Введение
В данной статье мы хотели бы остановится на теоретических аспектах создания градировочных зависимостей используемых в различных анализаторах молока и молочных продуктов. Заранее приносим свои извинения за ряд упрощений при описании некоторых терминов и понятий, которые сделаны сознательно для простоты и удобства чтения текста.
Что такое градировочная зависимость
Градуировка в целом — это процедуры (как экспериментальные так и теоретические) установления соответствия между измеренными значениями общих характеристик образца и количественным содержанием конкретного вещества или группы веществ входящих в состав образца. Конечную зависимость, по которой ведется последующий расчет, обычно выражают либо графически, либо математически в виде формул. Выбираемые для измерения характеристики образца зависят в первую очередь от возможности инструментального метода и насколько устойчиво коррелирует данные характеристики с конкретным показателем состава пробы. В целом для молока и молочных продуктов такими характеристиками могут являться теплоемкость, физическая плотность, оптическая плотность в определенном диапазоне, рассеивание и ряд других, а также любые характеристики являющиеся производными перечисленных. Требования к такому измерению в основном касаются получения четкого аналитического сигнала, желательно с максимально стабильными свойствами и большим селективным откликом на измеряемый показатель. Поскольку теоретические аспекты проведения измерения с использованием различных инструментальных методик описаны в открытой литературе, именно улучшение указанных свойств и является задачей производителя приборов. А вот эти данные в основном являются «ноу-хау» компаний занимающихся производством аналитического оборудования.
Наши «ноу-хау»
Что бы читатель имел представление, как это происходит немного остановимся на разработках сделанных в нашей Компании. По понятным причинам конечно в общих чертах и без конкретики. ООО НПП «БИОМЕР» занимается разработкой ультразвуковых (далее УЗ) анализаторов (и молока в частности) уже более 10 лет. Теоретические же аспекты УЗ измерений молока были разработаны много раньше. Стандартный вариант использование УЗ-метода контроля состава молока (описанный в специализированных учебниках) основан на измерении скоростей распространения ультразвуковых колебаний в зависимости от массовых долей жира и сухого обезжиренного молочного остатка (СОМО) в молоке, определенных при температурах пробы t1 и t2 и связанных между собой следующими соотношениями:
V (молока, t1) = v (воды, t1) + a1*Cж + b1*Cсомо; (1)
V (молока, t2) = v (воды, t2) + a2*Cж + b2*Cсомо; (2)
Где, V и v — скорости ультразвука в молоке и воде; Сж, Ссомо — массовая доля жира и СОМО в молочном продукте; а и b — коэффициенты.
Таким образом, измеряя скорость распространения ультразвука в одной и той же пробе молока при температурах t1 и t2 и решая систему уравнений относительно Сж и Ссомо получают данные о массовой доле компонентов. Скорость распространения ультразвука в молоке определяется рядом факторов, рекомендуемые в литературе значения t1 = 41 °C и t2= 65 °C.
Что напрямую следует из данных уравнений:
1. Точность измерения будет зависеть от точности поддержания температуры, а значит процесс нагрева должен быть регламентированным и равномерным. Это накладывает ограничения в первую очередь на скорость измерения, особенно с учетом вариаций в исходной температуре пробы. Ждать высоких точностных характеристик при быстром нагреве образца не следует. В нашем анализаторе установленное объективно минимальное требуемое время, которое без снижения точности позволяет поддерживать требуемые условия термостатирования. Кроме этого дополнительную стабильность температурного нагрева придает конструкция и материал измерительной ячейки. Именно по этой причине конструкция и материалы ячейки за последние несколько лет претерпела значительные изменения, что позволило значительно повысить точность поддержания температуры. И эти работы продолжаются.
2. В уравнении участвуют УЗ характеристики воды следовательно в любой момент измерения они должны быть известны. Именно поэтому следует постоянно и тщательно контролировать показания анализатора с использованием дистиллированной воды, и при необходимости их корректировать, в наших анализаторах эта процедура поддерживается с помощью функций «Самотестирование» и «Коррекция нулей».
3. Прецизионность измерений зависит от точности измерений скорости УЗ, по данным литературных источников (ВНИМИ), измерение скорости ультразвуковых колебаний следует проводить с погрешностью не более +0,005м\с. Для применяемой сегодня в наших анализаторах измерительной ячейки погрешность такого измерения в десять раз меньше.
4. Для того, чтобы раздельно рассчитать содержания жира и СОМО, эти два показателя должны иметь «разнонаправленный» аналитический отклик, в противном случае данная система уравнений будет вырожденной. Этот математический по сути факт говорит о невозможности определить концентрацию вещества в смеси с аналогичными (близкими по ультразвуковыми характеристиками).
5. В следствии п. 4 УЗ метод не может напрямую измерить содержание белка в образце (то есть корректно отделить его от остальных веществ составляющих СОМО), для определения белка используются ряд дополнительных параметров пробы. Они (параметры) различны для разных конструкций приборов и у разных производителей. Но в целом в любом случае точность такого определения низкая. Именно по этой причине в разработанном нашей компанией в анализаторе Клевер-2М предусмотрен режим измерения (2 режим) позволяющий разделить компоненты СОМО и провести измерение белка (а также лактозы и минеральных солей) с более высокой точностью. Следует отметить, что приведенные уравнения 1−2 не являются догмой, наша компания ведет также работы по модификации имеющихся и созданию новых алгоритмов расчета. Об этом будет сказано чуть ниже.
Теория градуировки
Диапазон. В первую очередь при создании градуировки для молока и молочных продуктов вне зависимости какой для этого применяется инструментальный метод следует определится с диапазоном измеряемых концентрации. Как правило выбирается некий рабочий диапазон в котором концентрации измеряемого компонента адекватна предложенному способу измерения и градуировочной модели. Общепринято, что по многим причинам, для исследования образцов с низким содержанием искомого компонента (на уровне фона) или высоким (более 50%) должна быть применена либо отдельная пробоподготовка, либо регламентирована более низкая точность измерения. Особенно внимательно следует относится к использованию любой даже стандартизированной методики в области нулевых концентраций, как правило в этой области затруднительно или бессмысленно применение указанных в методике погрешностей.
Аналитический сигнал. Вторым важным фактором для создания градуировки является аналитический отклик. Как уже говорилось важно, что бы отклик был интенсивным и однозначным. То есть четко определяемым на фоне всех остальных и селективно описывающим конкретный показатель. Более того с технической точки зрения (в зависимости от устройства прибора) сигнал должен быть стабильно воспроизводимым, мало подверженным внешним физическим факторам и влиянию матрицы образца.
Форма градуировочной зависимости. В большинстве случаев мы привыкли рассматривать градировочную зависимость как прямую линию. В самом простом виде в виде прямой соединяющей реперную точку с началом координат. Это не совсем правильно. Теоретически прямолинейный участок как правило определятся как раз рабочим диапазоном, для которого и устанавливаются вид и форма градуировочной зависимости. Отклонения от линейности как правило имеют место в области низких и высоких концентраций, что приводит к необходимости «подгонять» параметры пробы под рабочий диапазон, как было сказано выше. Бывают случаи когда разработчики включают диапазоны нелинейности в рабочий диапазон, вводя например соответствующие поправки. А там, где это принципиально (то есть собственно отклик аналитического сигнала имеет нелинейный характер) используют градуировки соответствующего вида и формы (например S-образной), то есть описывают градуировочную зависимость в виде подходящей математической функции. Зачастую градировочная зависимость является многомерной, как например в указанных выше расчетах для УЗ метода определения жира и СОМО, она представляет собой плоскость.
Формулы
Рассмотрим более детально возможности градуировки с использование УЗ метода, поскольку эти возможности нам известны как теоретически, так и на практике. Зависимость скорости УЗ от концентрации вещество различны и крайне чувствительна к используемой частоте, температуре и свойствам объекта. Если ограничится рассмотрением только водных растворов (эмульсий) органических и неорганических веществ, в целом при определённой частоте и температуре, как правило такая зависимость от нуля до определённой концентрации имеет линейный участок, после чего становится нелинейной. Что и следует ожидать с учетом того, что скорость УЗ теоретически зависит не от концентрации веществ, а от их молярности, и дополнительно от адиабатической сжимаемости которая априори не может быть постоянной во всем диапазоне концентраций. Это «тонкости» которые мы сознательно не будем рассматривать в нашем обсуждении, конечно упрощая при этом градуировку, но мы о них всегда помним и учитываем. С учетом этого упрощения можно формулу расчета концентрации можно представить в следующем виде:
V (объекта, t1) = v (воды, t1) + a1`*Cобъекта; (3)
Как видим для определения концентрации, достаточно при градуировке установить коэффициент «а» и если зависимость линейная, то считая константной скорость распространения УЗ в воде при данной температуре, можно пользоваться уравнением 4.
Cобъекта = (V (объекта, t1)*a1 + Const1 (4)
Аналогичная зависимость может быть рассчитана для любой другой температуры.
Cобъекта = (V (объекта, t2) *a2 + Const2 (5)
Можно ли учитывать второе и последующее уравнение при расчете конечной концентрации. По нашему мнению — нужно, причем желательно создать общую градуировочную зависимость, по которой концентрация будет рассчитываться как
Cобъекта = V (объекта, t1)*b1 + V (объекта, t2)*b2 + Const1−2 (6)
Такая градуировка является более устойчивой, два (или несколько) в целом равнозначных члена взаимокомпенсируют возможные изменения внешних и внутренних условий единичного измерения. Параметры измеряемые в процессе измерения характеристик УЗ состоят не только из скорости распространения ультразвука, но из ряда других (например затухание УЗ), более того некоторые из них напрямую не относятся к УЗ (например теплоемкость). Можно ли их использовать? Нужно. При использование затухания УЗ выраженного через амплитуду сигнала (А) уравнение расчета концентрации может быть следующее.
Cобъекта = А (объекта, t1)*а1 + ConstА (7)
Комбинация формул 4 и 7 позволяет решить систему уравнений типа 1−2 для двух составляющих в образце, даже в случае если их УЗ характеристики скорости близки, но при этом характеристики затухания УЗ резко отличаются. Теоретически при наличии в смеси неопределённого количества составляющих можно создать неопределённое количество уравнений типа 4 (по всем имеющимся свойствам объекта) и пытаться однозначно разрешить получившуюся систему для каждого компонента. К сожалению, как уже говорилось не всегда это получается. Логичным способом позволяющим решить такую задачу является количественное видоизменение либо удаление из системы искомого компонента, фиксация изменений УЗ свойств всего образца и расчет искомой концентрации компонента в зависимости от полученных изменений. Например, такой подход применялся ранее при определении состава молочной продукции на основании измерения УЗ характеристик самого молока и полученного из него обрата (обезжиренного молока).
Мы привели вышеизложенные расчеты и формулы (конечно далеко не полные), для того, что бы было понятно, как теоретические посылы в решении аналитических задач на практике превращаются в огромное количество возможных вариантов схем и алгоритмов расчета. Выбор и применение конкретного подхода является прерогативой разработчика оборудования. Это и есть «ноу-хау» заключающее в себе и интеллектуальный потенциал производителя и его конкурентные преимущества. Ну и что бы читателю было понятно, что не существует оптимальных инструментальных методик заведомо лучше любых других, можно рассмотреть какие подходы применяются при создании градуировок например в инфракрасных анализаторах ближнего спектра (БИК). Вот как выглядит система уравнений для анализа зерна и одновременном расчете масел (жира) влажности и белка.
Масло% = K0+K1(ΔOП)в+K2(ΔOП)м+K3(ΔOП)п
Вода% = K4+K5(ΔOП)в+K6(ΔOП)м+K7(ΔOП)п
Протеин% = K8+K9(ΔOП)в+K10(ΔOП)м+K11(ΔOП)п
Где, (ΔОП)В, (ΔОП)М и (ΔОП)П представляют собой изменения оптической плотности на двух длинах волн чувствительных к процентному содержанию соответственно влаги, масла и протеина. К0-К11 являются константами или коэффициентами влияния. То есть ΔОП=log (lп/lо)1-log (lп/lо)2, где (lп/lо)1 — отношение интенсивности падающего излучения к интенсивности отраженного излучения при одной выбранной длине волны, a (lп/lо)2 — отношение интенсивности падающего излучения к интенсивности отраженного излучения при второй выбранной длине волны.
Согласитесь, что формулы расчета напоминают уравнения 1−2.
В типичном случае анализаторы зерна применяют длины волн, выбранные в интервале приблизительно от 1100 до 2500 нм, однако есть данные что для муки влияние размеров частиц компенсировали дополнительным применением длины волны 450 нм.
Не напоминает ли этот факт сказанное выше в части применения амплитуды (уравнение 7)?
Если кому то представляется, что ИК спектроскопия не имеет тех же проблем про которые говорилось для УЗ измерений, то он заблуждается. В стандартных ИК спектрометрах при анализе молока для улучшения стабильности аналитического сигнала предусматривается система пробоподготовки, в этом случае проба гомогенизируется и нагревается до определённой температуры. Существует также понятие спектральное разрешение обуславливающее «качество» аналитического сигнала, что крайне важно при количественном анализе. Не менее важно накопление сигнала, то есть когда для конечного анализа используется не единичный спектр (один скан), а их массив, чем больше «сканов» тем лучше качество получаемого спектра. И здесь улучшение качества спектра требует увеличение времени анализа, в точности как и для УЗ методики анализа. И точно также зависимость величины сигнала от измеряемого компонента определяется не массовым содержанием вещества, а количеством его молей, что тоже вносит свои ошибки и сложности в расчет конечной концентрации вещества.
Конкретика
Теперь отягощенные значительным количеством «знаний», давайте рассмотрим конкретные возможности по созданию градуировок для молока и молочных продуктов сообразно тем теоретическим аспектам которые изложены выше. Для собственно молока диапазоны измеряемых макро компонентов (жир, белок, лактоза) лежат в относительно небольшом диапазоне, поэтому обычно весь диапазон является рабочим и градуировка охватывает все образцы цельного молока. Сложности возникают при возможном изменение относительного состава и свойств указанных компонентов. Так для анализа молока отличного от коровьего (например козьего) изменение состава белковой фракции может привести к значительным ошибкам расчетов. Следствием этого является необходимость создания индивидуальной градуировки в зависимости от породы животного. При переходе от сырого молока к обработанному необходимость градуировки обусловлена не столько изменениями в белковой фракции вызванные нагревом, сколько сопровождающей нагрев гомогенизацией образца при которой функциональное и пространственное распределение как жира так и белка претерпевает значительные изменения. Для такого молока особенно при отсутствии в анализаторе внутренней системы предварительной гомогенизации и нагрева пробы создание отдельной градуировки крайне желательно. Отдельно следует рассмотреть специальные градуировки для высококонцентрированных образцов, то есть образцов с высоким содержанием макрокомпонентов. К ним можно отнести образцы высокожирные сливки, концентрированное молоко, мороженное, йогурт, сыр, масло итд. Причем последние образцы по реологическим свойствам заведомо невозможно анализировать с использованием ИК анализаторов регистрирующих спектры пропускания образца или УЗ ячейкой требующей заливки образца. В наитивном виде такие образцы общепринято анализировать с использованием спектров отражения полученных как на стационарных приборах так и с помощью выносного датчика. Схема градуировки по таким спектрам не сильно отличается от описанных выше, в данном случае гораздо важнее пробоподготовка образца так как любой спектр отражения дает полную информацию о составе определенного поверхностного слоя анализируемого объекта. Для других (не ИК) диапазонов спектров правила создания градуировки несколько отличны от указанных выше, но общие подходы аналогичны. Возвращаясь снова к анализу градуировочных зависимостей веществ в широком диапазоне концентраций следует отметить следующие моменты:
1. В общем случае точность при опредлении количественного содержания макрокомпонента повышается с увеличением его относительной концентрации и наоборот при уменьшении относительной концентрации точность снижается.
2. Из п. 1 следует необходимость всегда различать относительную и абсолютную точность (погрешность) анализа, понимать их взаимосвязь и уметь пользоваться и применять в зависимости от обстоятельств. Что бы наглядно проиллюстрировать пп.1−2 приведём условный график точности одновременного определения жира и белка в сливках в зависимости от увеличения их жирности.
Что бы наглядно проиллюстрировать пп.1−2 приведём условный график точности (0−12%) одновременного определения жира и белка в сливках в зависимости от увеличения их жирности (0−60).
График 1
Как видим, что обозначенная синим цветом условная точность белка до определённой жирности будет иметь некое плато (зависящее от используемой методики) и далее уменьшаться с ее увеличением. Такой процесс объясняется тем что в высокожирных сливках количество белка становится минорным по отношению к жиру, такой эффект можно условно назвать влиянием матрицы. В общем случае используемая методика после определённой жирности перестает давать достоверные результаты. Даже в тех случаях когда теоретически применимость методики сохранятся (например если для ИК спектроскопии полосы поглощения которые приняты реперными для анализа сильно разнесены). В таких случаях для определения минорных компонентов как правило выбирается другой метод анализа предусматривающий выделение искомого вещества либо разделение веществ уже в процессе анализа. Либо речь уже не идет не о количественном, а о качественном анализе.
Также из графика следует что с уменьшением абсолютного значения жира относительная точность его опредления уменьшается. В принципе данная тенденция присуща всем градуировочным зависимостям в области нулевых концентраций. В этом случае также общепринят переход на другую методику предназначенную для определения микро количеств.
Аналогичный график отражающий изменения абсолютной точности представлен ниже. Видно, что при переходе от обрата к сливкам жирностью до 30% концентрации белка сохраняется в условно узком диапазоне (4−2% масс) и поэтому можно применить единое значение абсолютной погрешности. С увеличением жирности абсолютная погрешность определения жира пропорционально увеличивается. Как правило, следствием этого является не совсем корректная и удобная разбивка на диапазоны жирности и приписывание каждому диапазону определённой абсолютной погрешности. Для относительной погрешности такая разбивка как правило не нужна.
График 2
При дальнейшем увеличении жирности и соответствующем уменьшении содержания белка начинают сказываться все правила изменения точности описанные выше. Все сказанное в части точности в системе жир\белок можно применить и к другим более или менее сложным системам. Но для каждой такой системы характеристики точности являются индивидуальными и должны быть определены экспериментальным путем.
В заключении мы постараемся наглядно показать, как меняется градировочная зависимость и чем отличаются такие зависимости построенные на большом массиве данных (как правило это градуировки производителя) и зависимости построенные пользователем с минимальным количеством точек используемых для расчета. Оговоримся сразу, что все приведенные формы графиков весьма условны, мы хотели бы только зафиксировать некие общие тенденции и подходы, в каждом конкретном случае и приборе реализация данных подходов бывает различной.
График 3
На графике все условные точки (синий цвет) полученны производителем. Оранжевым те же самые условные точки, но полученные пользователем. Видно, что градуировочная зависимость производителя и пользователя приблизительно с одинаковой точностью описывают узкий диапазон измерений от 3 до 7. Вне этого диапазона градуировка пользователя покажет некорректные значения показателя.
График 4
Как крайний вариант при построении градуировки по одной точке можно получить зависимость (График 4) обозначенную красной линией. В случае же некой «коррекции» градуировки производителя (синий график исходная градуировка) на основе такой точки итогом коррекции может быть график обозначенный оранжевым цветом. По графику видно, что коррекция может не возвращать точное значения показателя указанное пользователем (точка 7,0), особенно если оно резко отлично от показателя рассчитанного по стандартной зависимости (4,0). Во многих случаях при попытке пользователя указать значение больше критического любая коррекция градуировки будет программно запрещена производителем.
Заключение
Мы вкратце описали и постарались обобщить принятые в настоящее время способы и методы построения градуировочных зависимостей для анализаторов молока. Надеемся данная статья будет полезна для понимания устройства работы анализаторов молока и правильного использования как заводских градуировок, так и градуировок выполненных в условиях эксплуатации приборов. Будем признательны за любые замечания и дополнения по делу.
Комментарии