В связи с изменениями и двусмысленносями происходящими с методикой «измерения Соматических Клеток (далее — СК) по изменению вязкости» предлагаем на рассмотрение обзор с нашим видением и пониманием теоретических и практических аспектов при проведении таких измерений.
Теория
ДНК. В нашем рассмотрении следует отметить следующее: ДНК есть в любой клетке. Для разных клеток она разная как по свойствам (по вязкости в том числе), так и по массе (количеству генного материала). Для лейкоцитов коровы разумной представляется цифра 7,8пг, но можно оперировать и диапазоном, например 6−9пг. В такой диапазон в первом приближении вписываются все разновидности и коров и их клеток. Зафиксируем, что это диапазон, а не абсолютное значение.
Другие компоненты влияющие на вязкость К другим компонентам можно отнести «клетки», не относящиеся к соматическими клеткам молока коровы и макросоставляющие собственно коровьего молока. Чем-то, можно пренебречь по причине минорного содержания или по причине низкой вязкости, но есть и чье влияние следует учитывать.
1. Белки и жиры. Хотя количество жира увеличивает вязкость, но влияние его принято считать незначительным. Влияние белков носит более комплексный характер, здесь нужно рассматривать не просто их содержание, но и структуру на тот момент, когда вы проводите измерения. Можно привести пример, что кефир и молоко имеют, при одинаковой массе белка, вязкость кардинально отличную. Зафиксируем этот момент. Лактозой и количеством солей, как в свободной, так и в связанной форме можно пренебречь, но следует отметить, что структура белка и неорганический компоненты взаимосвязаны. Фиксируем.
2. Ферменты, РНК, плазмиды, неядерное ДНК, части клеток подвергшиеся лизису итп. Теоретически такие микрокомпоненты принято не учитывать, или скажем нам не известно об их сколько-нибудь значительном влиянии.
3. Другие источники ДНК. Основной источник ДНК не относящихся к СК коровы — это различные формы микроорганизмов. Однако с учетом того, что такие формы являются прокариотами (то есть с низким содержанием генного материала) на обычных уровнях содержания микроорганизмов в молоке влияние незначительно. Однако в целом следует считать, что при больших значениях бакобсемененности молока вклад микроорганизмов в общую вязкость может быть значительный. Зафиксируем.
Собственно вязкость Вязкость есть характеристика свойств среды. Абсолютное значение вязкости может находиться в широких пределах. Общеизвестно, что растворы ДНК обладают большим значением абсолютной вязкости и именно это позволяет фиксировать изменения вязкости достаточно простыми способами, вязкозиметрами в частности.
Теоретическая зависимость содержания ДНК от вязкости представлена на графике (все цифры условные). В данном случае следует обратить внимание, что при изменении концентрации ДНК существует, некое начальное плато, затем условно линейное увеличение, затем экспоненциальный рост.
Внешне ДНК в чистом водном растворе — прозрачная вязкая жидкость, и есть несколько моментов, которые следует отметить для дальнейшего понимания практического применения такой зависимости.
1. Для получения конечной (максимальной) вязкости требуется некое время.
2. Далее со временем вязкость уменьшается. (это можно объяснить тем, что с начала ДНК должно «развернуться» то есть приобрести свою конечную форму в конкретной среде, затем она начинает реагировать с этой средой (в случае водных растворов гидролизуется).
3. Кроме этого указанные процессы, как и собственно конечная вязкость сильно зависят от температуры. Зафиксируем все три момента.
Принцип работы визкозиметрического анализатора СК
Принцип действия такого анализатора весьма прост. В молоко добавляют препарат «мастоприм» перемешивают и далее измеряется условная вязкость по времени вытекания через капилляр конкретного диаметра. Химиз процесса тоже не сложен, мастоприм — это смесь щелочи и детергента (обычно додецилсульфат натрия), под действием такой смеси идет лизис (разрушение) клеточных стенок, после чего ДНК выходит в раствор, резко повышая вязкость. Лизис с помощью детергентов считается «мягким» способом лизиса, в данном случае наличие концентрированной щелочи приводит к тому, что клеточные стенки разрушаются жестко и быстро. Для проведения экспресс-анализа именно это и требуется. К сожалению при таком разрушении отсутствует селективность, то есть кроме лизиса СК идет еще множество не контролируемых процессов.
Анализатор предназначен для анализа СК в средней концентрации, и не предназначен для подсчета низких и высоких концентраций. Это становится понятно если посмотреть на приведенный выше график, из которого следует то, что градуировка прибора работает в условно линейном диапазоне вязкости. Градуировка, «зашитая» в прибор (а фактически взятая из таблицы ГОСТа, см. ниже, в котором источник и применимость таблицы не регламентируется), описывает именно этот диапазон на основании взаимосвязи вязкость — количество ДНК — количество клеток, естественно со всеми указанными выше допущениями.
Возможны ошибки при измерении вязкости (не СК!) прямо указаны производителем и разработчиком наиболее распространенного анализатора «Соматос» — фирмой Костип (г. Москва) Кроме систематической ошибки при собственно измерении вязкости таким способом (например, от изменений толщины капилляра), есть еще ошибки связанные с собственно объектом измерения. Далее процитируем самого разработчика:
«…Значительно хуже обстоит дело в измерениях на молоке, смешанном с препаратом Мастоприм. Поскольку молоко является биологически активной жидкостью, в которую проникает прямо или косвенно, все вещества, принимающие участие в обмене животного с внешней средой, то не поддается описанию, что и почему приводит к образованию пены, сгустков, слизи
Стандартизированные методики (ГОСТ) регламентирующие измерения
Реальная погрешность Следует помнить, что арбитражным методом измерения СК является их прямой подсчет. Рассчитанные погрешности такого подсчета зависят от многих факторов, количества образцов, их характеристик, а также характеристик используемого для подсчета оборудования. Средние значения погрешностей лежат в интервалах 10−15% на средних концентрация СК (от 200−1000) и около 20−30% для низких концентраций (меньше 150). Данные цифры позволяют сделать оценку возможных погрешностей любых других инструментальных (не прямых) методов, с учетом того, что установочные градуировочные данные для конкретного прибора должны определяться с помощью арбитражных методов.
Визкозиметрические методики (старая и новая) На данный момент в «обороте» НД, которые используют пользователи могут находится как старая, так и новая стандартизированная методика измерения СК с использованием визкозиметров, без уточнения их производителей и характеристик. Обращаем вынимание что статус старой методики (ГОСТ 23 453−90) отмечен как «утративший силу в РФ». Чтобы не создавать двойственности в трактовке понятий и применимости результатов измерений рассмотрим последовательно термины старой и новой методики.
В части точности (погрешности) измерения в обеих методиках указано «допустимое расхождение времени вытекания (а не измеренного количества СК!) между двумя параллельными измерениями в соответствующем диапазоне не должна превышать столько-то секунд». И следующий пункт ГОСТа - «предел допускаемой погрешности измерения 10%» (по тексту тоже относится к времени вытекания, а не к СК). В части расчета количества СК, в старой методике прописано «количество соматических клеток рассчитывается по Таблице» (для старых визкозиметров). Приводим данную таблицу целиком.
В нашем понимании данной таблицы при любом показании времени вытекания в диапазоне указном в левой части таблицы, измеренное количество СК должно быть представлено в виде соответствующего диапазона правой её части.
Далее в
Таблица 2
Из данных видно, что отличие таблиц 1 и 2 заключается в разбиении на части каждого из диапазонов и времен вытекания. Как бы ни обсуждая, насколько корректно с точки зрения метрологии это сделано, отметим, что диапазоны (то есть представление результатов в виде диапазонов) остались. Также в новом ГОСТе осталась 10% погрешность определения времени вытекания (условной вязкости).
Все сказанные рассуждения подкреплены метрологическими характеристиками утвержденными при последних государственных испытаниях анализатора Соматос-В, где значение какой-либо погрешности определения СК вязкозиметром не приводится. В Описании Типа анализатора указано «предел относительной погрешности определения условной вязкости -7,5%» Именно эти данные указаны в характеристиках у производителя.
Утверждение об «относительной погрешности измерения СК в 5%», как зачастую указано у некторых производителей или в рекламной продукции недобросовестных перекупщиков является надуманным.
Практическое применения полученных данных
Все изложенное выше написано не для того, чтобы у читателя сформировалось негативное восприятие как вязкозиметрического метода определения СК, так и приборов которые работают по этому методу. Схема работы анализатора типа «Соматос» проста и доступна, не требует специальной пробоподготовки и обученного персонала, и отдельно следует отметить относительно невысокую цену и надежность приборов. В первую очередь мы хотели бы, что бы пользователь анализатора представлял все его ограничения и возможности и четко понимал, что за результат он получает в конечном итоге. Для этого следует обдумать все, то, что написано выше особенно, где стоит отметка «фиксируем». Решение за вами, но наш (возможно субъективный) подход, тоже можно принять к рассмотрению.
Наш подход
При рутинных анализах
- Обязательно проводить анализ молока в максимально одинаковых условиях, четко соблюдая все инструкции производителя желательно при одной кислотности и из одного источника.
- Применять анализ только для сырого необработанного молока. Любая «обработка» недопустима.
- При внесении полученных данных в протокол или для финансовых расчетов использовать диапазон из Таблицы ГОСТ Р 54 077, 23 453−2014.
- При требовании заказчика указать абсолютную цифру количества СК, рекомендовать заказчику указать методики которые такие цифры предусматривают.
При систематическом анализе и обработке больших массивов данных. Соблюдать пп. 1−4
- По возможности фиксировать данные раздельно для каждого сдатчика в виде массива данных, который можно подвергнуть статистической обработке (таблицы Exel). Данные таблицы следует вести в абсолютных значениях показаний прибора, а не в диапазонах. Желательно также использовать двухканальный анализатор, или всегда выполнять не менее двух измерений. Желательно в данную таблицу вносить также все контролируемые показатели входного контроля.
- В случае резкого изменения состава (жир, белок) и свойств молока (кислотность, термоустойчивость) от конкретного сдатчика, желательно зафиксировать этот момент и проводить обработку данных полученных после этого момента отдельно от предыдущих.
- Попытаться несколько раз параллельно с вашими измерениями определить СК другим анализатором или способом. По возможности арбитражным (прямой подсчет). Если все полученные «параллельные» значения имеют одинаковый систематический сдвиг, возможно, следует применить его для всего массива данных.
Следует понимать, что даже если вы не сможете установить явных закономерностей и однозначно оценить точность вашего анализатора, ведение статистики поможет избежать явных ошибок и промахов при ведении входного контроля.
Спасибо тем, кто прочел статью до конца, и заранее всем спасибо за любые дополнения и комментарии по делу.
Комментарии