Анализ белка по Кьельдалю. Коэффициент пересчета

В последнее время коэффициенту (фактору) пересчета общего аммонийного азота, определённого по методу Кьельдалю в массовую долю белка стало уделяться много внимания. Связано это как со вполне понятным стремлением установить точное содержание белка в объекте, так и с абсолютным непонятным желанием сделать это административным путем.

Проблема вариаций коэффициента пересчёта и в частности от содержания небелкового азота (далее НБА) существует давно, и никто этого не скрывает. Эта проблема обсуждается, имеются большое количество опубликованных литературных данных по теме, а также значительное количество частных мнений конкретных лиц и лабораторий, которые используют в своей деятельности анализ белка по Кьельдалю. В данной методике существуют ряд других проблем (кроме собственно коэффициента пересчета) здесь и зависимость результата от состава белковой фракции пробы, и от способа обработки пробы, и от реологии и состава самого объекта. Понятно, что для разных типов образцов и соответственно для различного вида деятельности лаборатории эти проблемы могут либо присутствовать в различной степени, либо вообще отсутствовать. Давайте сосредоточимся на самой близкой нам теме, на необработанном сыром молоке и на небелковом азоте именно в нём.

Предыстория.

Собственно, о методе и его истории написано много, мы тоже писали здесь. Так что разумно перейти сразу к сути осуждаемого вопроса. Откуда взялся коэффициент и сколько должно быть небелкового азота. Количество естественного (подчеркиваем) НБА в молоке по литературным данным составляет от 3−8% от всего азота, то есть средняя «ошибка» определения общего белка в молоке может составлять около 5%.

(NB!) Возможно, именно отсюда в наших нормативных документа (НД) возникает поправочный коэффициент, на который (согласно, например, стандартизированной методики ГОСТ 54 756–2011 — определение массовой доли сывороточных белков, поправка — 0,95) требуется умножить массовую долю определенного по Кьельдалю белка. Не совсем ясно к сожалению, почему именно на 0,95, ведь если мы определяем сывороточные белки должен учитываться НБА в сыворотке, а не в молоке.

В части собственно коэффициента имеются литературные данные, что первоначально данный коэффициент определялся не для смеси молочных белков, а для выделенного и условно чистого молочного казеина (sic !!!) и составлял 6,38. Он был получен из расчета, что в 100гр указанного белка содержалось 15,67 гр. азота. Долгое время это было общепринятое базовое значение, которое используется до сих пор. Понятное дело, что данный коэффициент имеет массу допущений — он никак не учитывает даже вариации макросостава белковых фракций молока, не говоря уже о генотипических различиях. Да и само значение (6,38) не является догмой во многих исследовательских работах для молока были предложены другие «уточняющие» коэффициенты, например, 6,34. Но на сегодня в большинстве случаев на официальном уровне (включая международную федерацию молока) продолжают использовать старый, и это трижды правильно! Почему, мы постараемся объяснить ниже.

Сначала про погрешности методов

Извечно возникающая в терминологии проблема, (весьма похожая на обсуждаемую далее проблему деления белка на истинный и общий), когда по факту нет четких и понятных разграничений в терминах и прописанных правил где и в каком случае эти термины применять. Для химика (не метролога) очевидно, что наиболее близок к истинному значению белок, напрямую выделенный и взвешенный, такие условно прямые методики измерения обычно стараются принять в качестве арбитражных (контрольных). У любых других косвенных методик анализа проблемы с пересчётом будут такие же, как и у методики Кьельдаля. Для биуратового метода будет аналогичный коэффициент, зависящий от количества пептидных связей, для его модификаций (Лоури) дополнительно еще и от количества тиоароматических групп. Понятно, что эти количества не являются константой и всегда будут зависеть от многих факторов, как и сам результат анализа соответственно. Отсюда согласно приятым в мире метрологическим «подходам» следует, что истинное значение может быть измерено, только с определённой долей неопределенности (не сочтите за каламбур), именно этот момент, то есть отсутствие абсолютно истинного значения будь то хоть трижды арбитражная методика или трижды государственный стандартный образец (СО), иногда трудно воспринимается россиянами, воспитанными исключительно в материалистическом духе. Также бывает проблематично понять и четко разделить распространяемые (если не сказать насаждаемыми) в текущем законодательстве типы неопределённостей (А и Б). Позволим себе упрощенно изложить наше частное видение термина неопределённости применительно к рассматриваемому случаю. Типа, А это неопределённость (кому удобно может считать это погрешностью) выведенная из формул математической статистики на основании некого конечного массива данных полученного экспериментально. Все формулы и правила их применения есть в учебниках, и именно эта неопределённость (типа А) как правило указывается в современных методиках (включая стандартизированные) и с большой долей вероятности приведенное в методике по определению белка в молоке методом Кьельдаля значение погрешности (0,03) получено именно таким способом. А вот неопределённость типа Б (В, англ.) это некая точностная характеристика которая учитывает ВСЕ наши знания об объекте и процессе проведении измерения, включая как объективные знания, так и субъективные. Эти знания можно упорядочить с помощью определённых математических приемов и включить, как это принято называть, в общий бюджет неопределённостей, но бывает это сделать проблематично или вообще невозможно. В былые времена в таких случаях использовался термин неисключённая систематическая погрешность, обычно она принималась равной нулю или пренебрежимо малой величиной, что иногда (не всегда к сожалению) оговаривалось в тексте самой методики.

Тут думается читателю было бы небезынтересно рассмотреть наши «подходы» при расчете неопределённости типа Б конкретно для случая определения общего белка в молоке по методике Кьельдаля. Ну самое первое — это учет погрешности пробоподготовки и средств измерений, участвующих в процессе анализа. Обычно для этого используют паспортные значения, например, погрешность (неопределённость) весов на которых мы взвешиваем навеску. Здесь в целом просто и понятно, например, если мы взвешиваем на аналитических весах с указанной паспортной погрешностью, то доля этой ошибки в общей неопредленности рассчитывается однозначно. Существуют также расчеты «ошибки эксперимента», например, имеются данные, где рассчитывались потери азота за счет образования комплекса с медью, если последняя использовалась в качестве катализатора при сжигании. Но бывает и более сложные случаи, в частности, как учитывать нелимитированные по сути выбросы и потери вещества (азота) при сжигании пробы, хотя конечно проще считать, что их нет, но по факту они существует. Точно также следует помнить, что в химии есть понятие «выхода реакции», и абсолютных (100%) выходов как правило не бывает, то есть во всех химических превращениях азота, прописанных в методиках использующих метод Кельдаля всегда существуют нерегламентируемые потери азота, аналогичные потери белка также существуют при разделении белковых фракций и в любых других процессах, переводящих белки из одного состояния в другое.

Вопросов здесь действительно много, но давайте вернемся к теме обсуждения. Если бы методика Кьельдаля подразумевала бы измерение аммонийного азота, то на этом можно было поставить точку и смысла считать далее неопределённость типа Б при пересчете азота на белок не было бы, но методика согласно своему названию подразумевает определение (измерение), а не расчет (термин — calculation в методиках ИСО) именно белка, поэтому мы обязаны включить в бюджет неопределенности любые известные нам ошибки коэффициента. Давайте попробуем сделать это применив как указано выше ВСЕ наши знания о предмете.

Итак, если читатель помнит, то коэффициент пересчета был изначально (более века назад) рассчитан и предложен для кислотно осажденного и очищенного казеина Хамарстеном и Сибелиенем (приносим извинения за вольный перевод фамилий), но в последствии были и другие расчеты, для молока предлагались значения 6,34, 6,30 и даже общепринятый для большинства пищевых объектов 6,25. В целом анализ имеющихся данных позволяет утверждать, что суммарный коэффициент для казеиновой фракции отличен как от альбуминовой, так и от фракции небелкового азота и в целом варьируется в интервале от 5,8 до 6,6 для индивидуальных и групповых белков молока. Более того коэффициент для одних и тех же молочных белков (например, альбумина), но полученный из разных источников тоже может варьироваться (до 0,1ед), это связано с точностью измерения собственно количества азота которая зависит от точности определения массы пробы при сжигании, а также вероятных вариаций состава в зависимости от источника получения образца и способа его очистки.

Далее следует рассмотреть к какому объекту мы в реальности применяем обсуждаемый коэффициент и какой белок рассчитываем. Здесь следует понимать, что молоко — это не искусственная смесь очищенных белков, белковая система молока состоит из весьма сложных белковых образований, отличающихся между собой как по составу, так и по своей пространственной структуре и взаимодействию с другими небелковыми элементами системы. Кроме этого существуют еще дополнительные условно белковые соединения (например, протеиды имеющие в составе неорганическую или липидную часть). Считать или не считать такие соединения белками и включать или не включать их в расчет общего белка на сегодня не определено. Аналогично можно отметить, что даже исключительно молочный белок — казеин тоже существует в виде мицелл сложного состава. Например, примерно 20% кальция, содержащегося в молоке, находится в виде комплекса с казеином. Будет ли данный кальций частью белковой фракции, а если да нужно ли тогда вычитать его массу из массы минеральных солей определённых при сжигании.

Также следует учитывать условия пробоподготовки и, обработки и собственно объект исследования. Так, например, очевидно, что при анализе по Кьелдалю казеина (на фильтре после осаждения) и сывороточных белков (в фильтрате) следует применять кардинально различные коэффициенты.

Как видим вопросов больше чем ответов, но в целом суммируя сказанное выше лично мы делаем (подчеркиваем мы, то есть это только наше мнение) вывод, весьма простой по логике, но нетривиальный с точки зрения существующего законодательства, что коэффициент может и должен быть разным с учетом всех известных случайных и систематических ошибок и подбирается индивидуально для конкретной лаборатории и объекта анализа. И в подтверждение сказанному, мы в явном виде указываем, какие именно коэффициенты пересчета применяются в лаборатории ООО НПП «БИОМЕР»:

— для молока 6,38,

— для фракции сывороточных белков 6,28

— для казеиновой фракции 6,45.

и именно эти значения будут указаны в любом нашем протоколе анализа, пока лаборатория по каким-либо причинам не примет решение их изменить.

Откуда взялись эти цифры.

— во-первых, следует помнить, что метод Кьельдаля — это только один из методов, и имеются другие способы определения белка, в которых не существует ошибки связанной с НБА.

— во-вторых существует определённые химические приемы по обработке пробы, которые позволяют исключить влияние НБА на конечный результат.

— ну и в-третьих всегда есть дополнительные косвенные данные позволяющие подтвердить или опровергнуть результат, полученный по методу Кьельдаля.

По последнему пункту отдельно хотелось бы уделить внимание «материальному балансу» при анализе молока. В кавычках потому что он конечно весьма условен и существует в рамках определённых допущений и погрешностей измерения каждого компонента. Поясним. Теоретически кто бы что и как не толковал современные способы подсчёта общего весового состава молока общепринято, что сухие вещества молока состоят из жировой, углеводной, белковой и минеральной части.

То есть сухой молочный остаток (СМО)=Жир+Белок+Лактоза+Соли.

Это подчеркиваем некое базовой понятие, можно далее рассуждать, что не весь жир — триглицериды, не все углеводы лактоза, а уж органические кислоты или мочевину отнести к солям, так вообще невозможно ни по названию, ни по способу измерения этих самых минеральных солей. Повторимся это допущения (как и те что описывались выше, про кальций итп), можно ли ими пренебречь при расчёте баланса или нужно обязательно учитывать решается индивидуально для конкретного случая и лаборатории, но в целом подчеркиваем, это должно соблюдаться поскольку это общая балансная база. Лично мы ее соблюдаем. Баланс должен «биться» (хим.), для нас СОМО это всегда СМО- Жир, и одновременно Лактоза+Белок+Соли (зола), а не Лактоза+Белок+Соли+некая известная\или неизвестная сущность.

Более того, существуют еще другие базовые измеряемые макропоказатели молока, в частности действительная плотность, одна тоже входит в баланс поскольку «общая» плотность складывается из плотностей молочных составляющих, или точка замерзания, которая зависит практически исключительно от количества растворенных веществ в плазме молока. Сообразно сказанному даже теоретически плотность молока не может выходить из регламентированного составом диапазона, и точка замерзания должна зависеть в первую очередь от массовой доли лактозы, а не титруемой кислотности или соматических клеток. Если это не так, значит в измерениях существует аналитическая ошибка, либо объект — анормальное молоко, либо вообще не молоко. Все сказанное можно отнести и к балансу общего белка, то есть.

Общий Белок = Казеин + Сывороточные Белки.

Таким образом суммируя и памятуя ВСЕ сказанное выше мы стараемся использовать систематически обоснованный коэффициент, и любые полученные нами данные единичного измерения, должны (по возможности конечно) быть подкреплены дополнительными анализами и расчетами. И именно из систематических данных которые были собраны и проанализированы на протяжении не одного года появились указанные выше коэффициенты, и именно эти значения (6,38, 6,28, 6,45) используются при калибровке наших приборов.

Но мы ни коим образом не считаем их догмой и, если мы обнаружим какой-либо фактор (неопределённость типа Б) их уточняющий мы обязательно будем его использовать и учитывать.

Политическо-законодательные аспекты.

Для этого сразу следует задаться вопросом, а почему хотя проблема коэффициента пересчёта и НБА известна давно химики аналитики на практике не жалуются о систематическом завышении содержания белка по сравнению с другими методиками (а это не много ни мало примерно 0.19%) и тем более не спешат решить проблему кардинально, то есть не используют никаких поправочных коэффициентов и продолжают рассчитывать белок по базовому коэффициенту (6,25 или 6,38), хотя можно было бы для молока сразу взять к примеру, 6,06, учтя таким образом среднее значение НБА. А происходит это (по нашему мнению, конечно) по той простой причине, что введение поправочных коэффициентов или что еще хуже перманентная актуализация коэффициентов пересчёта нарушает саму методологию анализа, анализ по Кьельдалю предназначен для определения содержания общего азота, и расчета (не измерения) общего (crude) белка. Для определения любого истинного (true) белка, будь то общая масса или масса отдельных фракций, существуют другие методики и способы, и анализ азота по Кьельдалю (или Дюма) при этом может быть частью такого способа. Введение любого волшебного поправочного коэффициента не превратит автоматически общий белок в истинный. Методологически в таком подходе мы тогда получаем даже не измеренное значение общего азота, а некое расчетное значение белка, которое будет возможно разумным, но к реальному измерению собственно белка никакого отношения не имеющее.

А как у них?

А у них в целом нет такой проблемы, просто в разных случаях используются разные «базы и уровни». На международном уровне в качестве базового значения для расчета за товар (payment testing) и показателей продуктов питания используется значения общего белка. Некоторые страны у себя используют для этих же целей и истинный белок. А вот для исследовательских целей вполне логично использовать значения истинного белка, что и делается. Вообщем все индивидуально.

Ну и напомним, что существует ИСО 8968, состоящих из N частей, в каждой из которых подробно описаны и сам метод, и коэффициенты, и полученные рассчитанные значения, и смысл, того, зачем и как это делается. Каким образом из «Определения азота по Кьельдалю и расчета содержания общего белка» у нас получается «Определение массовой доли белка методом Кьельдаля» вопрос риторический, но может в этом и есть корень зла?

Что будет?

Ну предположим на законодательном уровне для молока будет принято решение что-то изменить, тогда в первую очередь следует понимать проблемы, которые при этом возникнут.

  1. При переходе на истинный белок (например, путем применения зачастую используемой аддитивной поправки 0,19) все полученные результаты анализа белка по Кьельдалю станет невозможно сравнивать со старыми цифрами, прописанным в нормативно-правовых актах и архивных данных, включая статистические.
  2. Каким образом будет регламентировано нахождение соответствия между полученным таким образом истинным белком и белком, полученным по другим методиками и в частности инструментальными методами с использованием средств измерений, отградуированных или поверяемых по тому же методу Кьельдаля. Особенно в случае, если отдельно не выделено и не оговорено какой белок общий\истинный измеряется прибором.
  3. В каком документе будет прописано и регламентировано применение поправочного коэффициента для расчета истинного белка. Как этот документ будет соотносится с уже имеющимися.
  4. Кто (какая конкретно организация) и на основании каких данных (эксперимент, литературные данные) в итоге будет определять конкретное значение коэффициента.
  5. Как (технически) и в какие сроки будет осуществляться переход при внедрении термина истинного белка для расчета за товар. Как при этом будет урегулированные вопросы ценовой конкуренции.

Сразу оговоримся в случае принятия решения о неком принципиальном методологическом переходе с общего на истинный белок мы не призываем к его саботажу и не генерируем проблемы, и в целом не видим принципиальной разницы какой белок истинный или общий берется в качестве результата, мы за то, чтобы все пересчеты делались осмысленно и взвешено. Использование надуманного поправочного коэффициента и его административное введение особенно в рамках одного объекта анализа (молочка) и государства (РФ), окончательно запутает и терминологию и данные лабораторий и взаиморасчёт за товар. В последней части (мы уже писали об этом здесь) правильно, по нашему мнению, будет в случае использования методики анализа белка по Кьельдалю сразу фиксировать на уровне договоров коэффициент белка, который будет использоваться при расчете за товар. А лаборатория соответственно должна указывать в протоколе или в явном виде коэффициент пересчёта или только полученные значения по содержанию азота, оставляя способы пересчёта и абсолютное значения коэффициентов на усмотрение продавца и покупателя.

Ну вот все что хотелось бы сказать по данной теме на сегодня.

Спасибо за терпение тем, кто прочел до конца, и за любые комментарии по делу.

Пока нет комментариев